神經發言 Nervestalk

這次會議的keynote lecture（by Sergiu Pasca）是一道基礎科學的應用：在神經科學的研究中，目前對於如何在實驗室環境中模擬細胞的狀態，並進行觀察與操作，一直是一個難解的問題。其中，關於神經細胞遷移、突觸形成 (synaptogenesis)、軸突導引 (axon pathfinding)等過程，在活體中更是高度複雜且具有動態變化的，這也使得在in vivo觀察這些變化是非常困難的。傳統的 2D 培養系統（例如在培養皿中培養神經元）是可行的方法之一，但其缺點是少了一個維度，和體內神經元的三維排列結構仍然相差甚遠，更不用說這些細胞中產生的化學梯度以及細胞之間互動是難以在2D系統中模擬的。因此，科學界逐漸轉向以類器官 (organoids) 或組合體 (assembloids) 作為模型系統，希望能針對神經發育做出更細緻的觀察。

發展細胞模型的第一步：hCS

在臨床或基礎研究上，我們很難取得活體大腦的細胞，更遑論取得正確的細胞，或是觀察細胞與細胞之間的互動與突觸連接，不過，這項限制已經慢慢被突破。在研究初期，Pasca與Sloan 等人在 2015 年的研究¹中就開始討論如何從幹細胞誘導出神經前驅細胞 (neural progenitors)。這樣的概念其實延伸自先前的諾貝爾獎授予誘導幹細胞（iPSC）的方式，透過開發可重複培養的多功能幹細胞 (pluripotent stem cells)，並生成類似人類皮質組織的球體（human cortical spheroids, hCS），除了能夠模擬生物腦中的電生理性質，也能作為未來在研究腦部皮質發育與疾病模型的重要平台。重組後的hCS除了存有不同層次的皮質細胞以及 astrocytes ，這些細胞在轉錄體 (transcriptome) 上更與胎兒腦部發育階段相吻合。另外，這些重組的神經元也能呈現突觸誘發的活性，顯示hCS已經具備神經之間的互動能力。相比於單層2D的培養系統，hCS 已經更貼近胎兒腦發育階段，且具備更高的生理與發育相關性。在懷孕的第一期，我們的神經系統就已經產生多達500種不同的細胞種類，雖然hCS離這個目標仍有距離，但已經開啟了我們對神經系統發育認知的一大步。

從Organoid研究人腦發育

演講中提到的一篇2022年文章：Toward a cellular understanding of development and disease²，我認為是一篇值得細讀的文獻。作者在這裡除了強調利用幹細胞衍生類器官來模擬人類大腦發育過程的潛力，之後發展蓬勃的Assembloid的介紹也呈現在這篇文章中。在發育過程中，神經與周邊細胞的互動是非常複雜的，這除了包含神經本身的生成、遷移、分層 (lamination)、連結 (connectivity)、突觸建立 (synaptogenesis)以外，膠質細胞 (glial cell)、血管細胞 (vascularization)、與免疫細胞的參與皆是不可或缺的。不過，在傳統平面的細胞培養，仍有許多課題是無法被觀察到的，例如：細胞如何在空間中移動，以及突觸是如何互相連接。這些微環境與結構必須在3D結構中較能被精細呈現，另外也更能了解神經細胞之間的空間關係，甚至是發育因子濃度梯度的變化。綜上，我們需要擁有一個能接近真實大腦環境但又具備可操作的模型－organoid（類器官）於焉誕生。

Guided or Unguided Organoid

關於Organoid的建立，最大的問題就在於需不需要額外的資訊進行導引。未導引（Unguided）的Organoid 透過胚胎的自我調控 (intrinsically regulated progression)，將人類多功能幹細胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）置於3D細胞外基質（ECM）中，在沒有外加誘導因子的情況下自發分化。在這種狀態下，細胞已經能自發形成包括前腦 、間腦 、後腦等結構，但由於過程高度隨機 （stochastic），也使得在模型化時難以確保可重現性與統計效力，因此逐漸發展出Guided organoid的模式。導引式分化 （guided differentiation）模仿胚胎發育中已知的訊號分子，透過外加因子強制細胞進入特定的分化路徑。例如：研究通常使用 SMAD inhibition促使多能幹細胞分化為神經外胚層，接著再根據研究目的加入特定形成因子（morphogens）以引導幹細胞發育成特定的organoid。Paşca 團隊則提出一種無基質 (matrix-free)、懸浮式 (suspension-only) 的3D神經誘導方法，能在懸浮環境中形成人類前腦類器官 (human cortical spheroids, hCS)，且不需依賴外部支撐物即可自組成類似大腦皮質的結構。這項研究成果除了有高再現性與穩定性，甚至能夠長期培養至出生後的人腦發育研究，可以說是該領域的一大進展。

從 Organoids 進展到 Assembloids

講者接著提到了一種稱為 assembloid 的模型：即將來自不同區域（如皮質、前腦、海馬迴、紋狀體等）或來自不同細胞來源 (如神經元、星狀細胞、微膠細胞) 的 organoid 組合在一起，使它們彼此連接，模擬在腦內的交互作用。Pasca 認為這種策略能更真實地再現區域互動、遠距連結與動態變化。這說起來容易，但這個概念其實極度仰賴時空的精確整合（spatiotemporal integration），也就是：「對的細胞在對的時間在對的地點彼此連結」，最終才能表現類似人體中的複雜結構。這樣的構想在2019年由Pasca³的實驗室團隊提出，也促成不同階段的研究發展。

第一代的Assembloid主要是觀察細胞如何遷移（migration）。在Birey等人⁴的研究中，他們成功將背側前腦 organoid 與 腹側前腦 organoid 相互融合，在精美的圖片與動畫中，講者也展示了 GABAergic 抑制性神經元如何建立突觸。

第二階段，他們野心更大，希望能模擬長距離的神經連結，例如多個腦區的傳遞：例如丘腦–皮質 (thalamo-cortical)、皮質–紋狀體 (cortico-striatal)等互動。其中最令人驚豔的是他們重建了皮質–脊髓–肌肉 (cortico-spinal-muscle)的三區連結路徑（有興趣的可以去看這篇的Graphic abstract）⁵。最後，他們也努力嘗試四區連結的Assembloid，也就是人體的感覺傳遞系統（ascending somatosensory assembloid）。

下一步，他們希望能重現生物體中的軸向。因此，在將 Sonic Hedgehog (SHH)基因表現於幹細胞中以後，沿距離形成濃度梯度，成功將前腦 organoid「腹化 (ventralization)」藉此模擬胚胎中腹背梯度（dorsoventral gradient）。

最後一步，就是把神經細胞與其他有關細胞連結。大腦的真實發育情況並非只屬於神經細胞，而是神經外胚層、間質以及部分免疫細胞共同作用。因此，研究團隊開始在 organoid 中引入其他胚層的細胞，例如：microglia-like cells或pericyte-like cells ，也獲得許多研究成果。

其他發展

隨著技術進步，研究者得以長期培養這些 organoid，進一步模擬出生後 (postnatal) 階段的神經系統發育特徵。舉例來說，有人能夠觀察 DNA 甲基化年齡 (methylation age) 的變化；另有研究指出在約 280 天 (≈ 9 個月) 時，NMDA 受體亞型轉換 (NMDA switch) ，是神經系統發育的一個分水嶺 (switch) 時刻⁷。在比較人類與黑猩猩 (chimpanzee) 的差異時，這類模型也有應用價值：研究人員可以藉由將來自不同物種或不同遺傳背景的幹細胞導入相似3D結構，探究演化上的生物差異。另外，這些組合體模型還可以搭配 CRISPR 基因編輯技術來模擬或鑑定某些神經疾病的基因效表型，進一步探索相關疾病。一些移植的相關實驗也是應用的一部份，例如：該團隊在將人類皮質 organoid 移植到新生大鼠腦部後⁸，這些 organoid 能夠向宿主大腦延伸軸突、與宿主電路接合，並呈現突觸活動，顯示這類移植模型能展現 in vitro 模型中看不到的迴路層級表現。

結論

每次聽完這種超大型Presidential lecture，都覺得酣暢淋漓，腦子被塞滿各種奇怪但又有趣的知識。但這種以各種腦模組（module）建構的模型，除了可以模仿胚胎發育，也讓我們可以在實驗室中進行腦部的操縱與觀察，對未來疾病的診斷與治療勢必是一大進步。

參考文章

1. Paşca, A., Sloan, S., Clarke, L. et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods 12, 671–678 (2015). ↩︎
2. Kelley KW, Pașca SP. Human brain organogenesis: Toward a cellular understanding of development and disease. Cell. 2022 Jan 6;185(1):42-61. doi: 10.1016/j.cell.2021.10.003. Epub 2021 Nov 12. PMID: 34774127. ↩︎
3. Paşca SP. Assembling human brain organoids. Science. 2019 Jan 11;363(6423):126-127. doi: 10.1126/science.aau5729. PMID: 30630918. ↩︎
4. Birey F, Andersen J, Makinson CD, Islam S, Wei W, Huber N, Fan HC, Metzler KRC, Panagiotakos G, Thom N, O’Rourke NA, Steinmetz LM, Bernstein JA, Hallmayer J, Huguenard JR, Paşca SP. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 2017 May 4;545(7652):54-59. doi: 10.1038/nature22330. Epub 2017 Apr 26. PMID: 28445465; PMCID: PMC5805137. ↩︎
5. Andersen J, Revah O, Miura Y, Thom N, Amin ND, Kelley KW, Singh M, Chen X, Thete MV, Walczak EM, Vogel H, Fan HC, Paşca SP. Generation of Functional Human 3D Cortico-Motor Assembloids. Cell. 2020 Dec 23;183(7):1913-1929.e26. doi: 10.1016/j.cell.2020.11.017. Epub 2020 Dec 16. PMID: 33333020; PMCID: PMC8711252. ↩︎
6. Pașca SP, Arlotta P, Bateup HS, Camp JG, Cappello S, Gage FH, Knoblich JA, Kriegstein AR, Lancaster MA, Ming GL, Muotri AR, Park IH, Reiner O, Song H, Studer L, Temple S, Testa G, Treutlein B, Vaccarino FM. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 2022 Sep;609(7929):907-910. doi: 10.1038/s41586-022-05219-6. Epub 2022 Sep 28. PMID: 36171373; PMCID: PMC10571504. ↩︎
7. Gordon A, Yoon SJ, Tran SS, Makinson CD, Park JY, Andersen J, Valencia AM, Horvath S, Xiao X, Huguenard JR, Pașca SP, Geschwind DH. Long-term maturation of human cortical organoids matches key early postnatal transitions. Nat Neurosci. 2021 Mar;24(3):331-342. doi: 10.1038/s41593-021-00802-y. Epub 2021 Feb 22. PMID: 33619405; PMCID: PMC8109149. ↩︎
8. Revah O, Gore F, Kelley KW, Andersen J, Sakai N, Chen X, Li MY, Birey F, Yang X, Saw NL, Baker SW, Amin ND, Kulkarni S, Mudipalli R, Cui B, Nishino S, Grant GA, Knowles JK, Shamloo M, Huguenard JR, Deisseroth K, Pașca SP. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 2022 Oct;610(7931):319-326. doi: 10.1038/s41586-022-05277-w. Epub 2022 Oct 12. PMID: 36224417; PMCID: PMC9556304. ↩︎